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Jun 17, 2023

Retrato de comunicaciones intensas dentro de redes neuronales de microfluidos.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12306 (2023) Citar este artículo 1882 Accesos 4 Detalles de Altmetric Metrics Las redes de modelos in vitro podrían proporcionar modelos celulares de relevancia fisiológica

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12306 (2023) Citar este artículo

1882 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

Las redes modelo in vitro podrían proporcionar modelos celulares de relevancia fisiológica para reproducir e investigar la función básica de los circuitos neuronales en un chip en el laboratorio. Desde la última década se han desarrollado varias herramientas y métodos para construir redes neuronales en un chip; entre ellos, los circuitos de microfluidos parecen ser un enfoque muy prometedor. Una de las numerosas ventajas de este enfoque es que preserva los compartimentos somáticos y axonales estables a lo largo del tiempo debido a barreras físicas que impiden que el soma explore áreas no deseadas y guían a las neuritas a lo largo de vías definidas. Como resultado, se pueden identificar y aislar compartimentos neuronales, y se puede modular su interconectividad para construir una red neuronal topológica (NN). Aquí, hemos evaluado hasta qué punto el confinamiento impuesto por el entorno de microfluidos puede afectar el desarrollo celular y dar forma a la actividad NN. Con ese objetivo, las matrices de microelectrodos han permitido monitorear la evolución a corto y mediano plazo de la activación neuronal durante el período de cultivo en ubicaciones específicas en redes organizadas (microfluídicas) y aleatorias (control). En particular, hemos evaluado la tasa de picos y ráfagas, así como las correlaciones entre los trenes de picos extraídos durante las primeras etapas de maduración. Este estudio nos permitió observar intensas comunicaciones de neuritas que habrían sido más débiles y retrasadas dentro de redes aleatorias; la tasa de picos, el estallido y las correlaciones se refuerzan con el tiempo en términos de número y amplitud, superando las características electrofisiológicas de los cultivos estándar. Más allá de la mayor eficiencia de detección que se esperaba de los canales de microfluidos, el confinamiento de las células parece reforzar las comunicaciones neuronales y el desarrollo celular en toda la red.

Los sistemas modelo in vitro son de principal interés para proporcionar una arquitectura neuronal definida por el usuario y para estudiar la organización y los procesos celulares en el laboratorio. Para ello, se han desarrollado varios métodos para construir redes neuronales fisiológicamente relevantes a partir de cultivos de células planas1,2,3 hasta cultivos de células 3D4 y órganos en chips5,6,7. Estos enfoques han logrado aislar en un chip mecanismos celulares específicos que podrían pasar desapercibidos in vivo.

El primer método, que consiste en cultivos de neuronas disociadas, presenta varias ventajas. Aunque la estructura de los tejidos se pierde en su mayor parte, se puede lograr un alto grado de control bioquímico y biofísico, en concomitancia con un acoplamiento miniaturizado y altamente eficiente con dispositivos eléctricos para registros a largo plazo. Una limitación de estos modelos es la organización aleatoria de somas y neuritas. Esto complica la observación de las mismas células o neuritas a lo largo de su desarrollo e impide evaluar la plasticidad de la red. Además, no se pueden separar diferentes poblaciones, lo que restringe el estudio únicamente a la comunicación intrapoblacional. Por lo tanto, varios estudios han intentado estructurar redes neuronales in vitro limitando la ubicación del soma y el crecimiento de neuritas, proporcionando una forma adecuada de estudiar neuronas individuales y su interacción en el transcurso de semanas. En primer lugar, la combinación de polímeros adhesivos y repelentes permitió la guía de las neuronas a lo largo de patrones definidos y condujo a las primeras arquitecturas funcionales construidas en el laboratorio8,9,10. Si bien este enfoque logró aislar y conectar un pequeño número de células, persisten desafíos para estructurar poblaciones grandes. Además, las neuronas aún pueden llegar a áreas no deseadas después de un par de semanas. Por lo tanto, se desarrollaron microestructuras para proporcionar barreras físicas adicionales y evitar la migración de células móviles11. Entre ellos, los circuitos de microfluidos basados ​​en PDMS han surgido como herramientas muy versátiles que proporcionan muchas propiedades adecuadas para posicionar, cultivar e interconectar grandes poblaciones de neuronas12,13. Desde las primeras demostraciones, los microfluidos basados ​​en PDMS se han utilizado para modelar circuitos cerebrales en un chip14,15,16,17, así como para el análisis de una sola neurona18,19,20,21,22. Este enfoque combina un recubrimiento adhesivo para neuronas y barreras físicas para una adhesión celular eficiente y arquitecturas estables en el tiempo13,23,24,25,26 manteniendo al mismo tiempo una alta transparencia óptica para imágenes de alta resolución27,28. Además, los dispositivos de microfluidos se pueden ensamblar con cualquier sustrato, incluidos conjuntos de dispositivos eléctricos4,29,30,31,32,33,34 para monitorear la actividad de la misma célula y cómo evoluciona su actividad con el tiempo. De hecho, esta combinación cumple condiciones esenciales, que son el mantenimiento a largo plazo del circuito neuronal definido35,36 y el acoplamiento eficiente entre neurona y dispositivo37,38,39,40.

Estas plataformas híbridas electrónicas y de microfluidos se han utilizado ampliamente, por ejemplo, para estudiar la propagación de picos40,41,42,43,44,45,46,47 y las relaciones estructura-función8,48,49,50. Como ejemplo, el diseño de doble compartimento ampliamente utilizado permite mantener los somas en grandes cámaras somáticas para aislar las poblaciones, mientras que los axones y las dendritas exploran canales fluidos estrechos alineados con los dispositivos sensores (Fig. 1). Por lo tanto, se podría obtener una red neuronal (NN) con conectividad localizada y sintonizable, proporcionando componentes clave para una red topológica, es decir, una con propiedades funcionales definidas geométricamente.

Descripción de las redes neuronales (NN) (a) que muestra las arquitecturas de red esperadas dentro de las muestras aleatorias (izquierda) y de microfluidos (derecha). (b) El diseño y la micrografía óptica de los NN de microfluidos ensamblados con las matrices de microelectrodos. Las neuronas disociadas extraídas de hipocampos de embriones de ratón se siembran dentro de los canales fluídicos de mm de ancho del chip de microfluidos (verde azulado). Si bien el soma puede unirse y explorar únicamente la cámara somática, las neuritas también muestran un crecimiento dentro de los microcanales estrechos y la cámara sináptica (área roja). (c) Diseño del chip de microfluidos utilizado para inducir la comunicación direccional. Para cada compartimento de microfluidos, los esquemas ilustran ejemplos de vías impulsadas geométricamente para dendritas y axones y ejemplos de nodos resultantes (somas aferentes y eferentes) que podrían esperarse dentro de las cámaras somáticas (nodos activos y ocultos en azul y gris, respectivamente).

Por otro lado, los circuitos de microfluidos imponen importantes restricciones espaciales al crecimiento en comparación con las condiciones de cultivo estándar en medios líquidos abiertos. Se espera que estas limitaciones den forma a la organización de la red y afecten el desarrollo celular24. Por tanto, es de primordial interés evaluar en qué medida un circuito de microfluidos induce cambios significativos en las comunicaciones neuronales y la maduración eléctrica de una red. En particular, se espera que la conectividad desempeñe un papel importante en la modulación de la maduración de NN, pero a menudo permanece oculta o es difícil de evaluar en las condiciones de cultivo estándar.

Aquí, investigamos el establecimiento de actividad eléctrica y el surgimiento de correlaciones espaciotemporales dentro de redes neuronales organizadas (microfluídicas) y aleatorias (control) de los mismos lotes de neuronas disociadas (Fig. 1a). Los NN definidos se cultivaron en una serie de microelectrodos para evaluar varias características electrofisiológicas con el fin de investigar los impactos del entorno de crecimiento en la maduración celular y en la aparición de patrones de actividad.

La topología de los NN de microfluidos se diseñó como una arquitectura de dos compartimentos separados por microcanales y una cámara intermedia, como se describe en las figuras 1a y b. El diseño de microfluidos incluye canales grandes (área verde azulada) a ambos lados del circuito de microfluidos, que sirven para sembrar somas. Las barreras físicas impiden que los somas migren fuera de estas grandes cámaras. Sin embargo, los microcanales de 5 µm de altura y una cámara intermedia (área roja) permiten que las neuritas se propaguen y conecten los compartimentos fluídicos a lo largo de vías definidas. Debido a la cinética de crecimiento mejorada de los axones, se espera que los microcanales largos y rectos (> 500 µm de longitud) los favorezcan y eviten que las dendritas conecten poblaciones distantes.

La Figura 1c ilustra los posibles esquemas de conexión y guía de neuritas. De izquierda a derecha, los primeros y más cortos microcanales deberían favorecer el crecimiento de neuritas desde la cámara somática a la sináptica. A partir de ahí, se espera que las dendritas se extiendan a lo largo de esta cámara central de 3 mm de ancho, mientras que los axones, por el contrario, pueden crecer en línea recta hacia los canales opuestos o girar hacia la cámara somática. En una entrada de los microcanales de axones largos, los microcanales cortos sin salida deberían evitar un circuito cerrado axonal, que bloquearía los axones en el microcanal largo. Esas trampas deberían guiar a los axones hacia el microcanal corto y la cámara somática. El último esquema ilustra una lista simple e incompleta de ejemplos de conectividad que pueden resultar de estas reglas rectoras en el caso de uno o dos nodos ubicados en una cámara somática. Pueden estar involucrados nodos activos y ocultos (círculos azules y grises, respectivamente).

Luego, los circuitos de microfluidos se ensamblan con chips electrónicos en los que las matrices de microelectrodos se alinean con precisión con los compartimentos y microcanales de fluidos (Fig. 2). Por lo tanto, varios dispositivos de grabación pueden rastrear eficientemente la propagación de picos dentro de las neuritas y al mismo tiempo monitorear la activación del soma.

Micrografías ópticas y fluorescentes de redes aleatorias y de microfluidos que muestran la distribución homogénea de somas dentro del área aleatoria de muestras de control (a) y de microfluidos (b,c) y la amplia exploración de neuritas dentro de todos los compartimentos fluídicos, incluida la cámara somática (c ), los microcanales y la cámara sináptica (d – f). La tinción por inmunofluorescencia se realizó después de 14 días en cultivo. Se eligieron DAPI, antisinapsina y antitubulina (YL1/2) como marcadores para marcar los núcleos celulares, las sinapsis y el citoesqueleto, respectivamente.

Para ambas condiciones de crecimiento, se sembraron células primarias extraídas de neuronas del hipocampo en matrices de microelectrodos recubiertos con poli-l-lisina y se cultivaron en medios condicionados por glial (mismo cultivo para ambas condiciones). Por lo tanto, las propiedades del sustrato y las condiciones de cultivo siguieron siendo las mismas para los dos lotes de muestras (detalles en "Materiales y métodos"). En la cámara somática, las neuronas estaban bien dispersas y las neuritas cubrieron homogéneamente la superficie del sustrato subyacente, formando una malla muy enredada (Fig. 2b). Además, las neuritas exploraron ampliamente la cámara sináptica (Fig. 2d), lo que confirma su propagación eficiente dentro de los microcanales cortos, así como el filtrado eficiente de los somas (Fig. 2e). La Figura 2f ofrece una vista más cercana de la unión con la cámara sináptica. Se espera que el intrincado entrelazamiento de neuritas y su proximidad dentro de los microcanales refuerce la eficiencia del acoplamiento de neuritas y la modularidad de la red. Estos primeros resultados evaluaron el crecimiento saludable y eficiente de las neuronas en los compartimentos de microfluidos, que lograron proporcionar la estructura de red esperada, principalmente manteniendo los compartimentos del soma y las neuritas en la ubicación deseada.

La Figura 3 muestra la actividad representativa registrada dentro de las redes aleatorias y organizadas el día 6 in vitro (DIV6). Como se observa claramente, la cantidad de electrodos activos y la tasa de picos son significativamente mayores en el NN de microfluidos organizado (Fig. 3a y b). Además, la cantidad de picos aislados en comparación con los eventos de ráfaga fue mayor que en los controles (Fig. 3c). Por lo tanto, la modularidad de los NN de microfluidos parece mejorada dentro de la red de microfluidos (configuración de doble compartimento que se muestra en la Fig. S1).

Patrones de actividad de NN aleatorias y organizadas. Comparación de la actividad neuronal de neuronas del hipocampo cultivadas en configuración aleatoria (columna izquierda) y en un chip de microfluidos (columna derecha). Los registros se adquirieron 6 días después de la siembra (6 días in vitro). (a) Curso de tiempo típico de 50 s de un canal de grabación del MEA dentro de la muestra aleatoria de control (izquierda) y dentro de un microcanal axonal (derecha). ( b ) Gráficos ráster de todos los eventos que cruzan el umbral negativo de 5 desviaciones absolutas medias para los 64 canales de grabación del MEA en las condiciones de control y microfluídicas (izquierda y derecha respectivamente). Los puntos rojos resaltan ejemplos de estallidos colectivos. (c) Evolución de la actividad neuronal durante el tiempo de cultivo para NN aleatorios (azules) y organizados (rojos), en términos de lo siguiente (de izquierda a derecha): tasa media de picos por electrodo activo (mínimo 0,1 Hz, tasa media de disparo), número de electrodos activos, tasa media de ráfaga y duración de la ráfaga. Las tasas medias de picos y ráfagas se extraen de las trazas de voltaje para cada canal de grabación y se promedian entre todos los electrodos activos (60 electrodos en total, el mismo cultivo para todas las condiciones). Significancia estadística ***p < 0,001 (prueba t de Student).

Tenga en cuenta que se espera que los electrodos ubicados dentro de los microcanales tengan una alta resistencia de sellado porque la sección transversal del canal es pequeña y está llena de material celular. Como resultado, se cree que la eficiencia de detección de dichos electrodos aumenta en comparación con la de sus homólogos de cámaras sinápticas y somáticas44. Este efecto relacionado únicamente con la condición de medición podría aumentar artificialmente el nivel de actividad observado en los NN de microfluidos. Sin embargo, la tasa de aumento medida en la cámara sináptica no siguió esa tendencia. Si bien este compartimento era similar a la cámara somática en términos de condiciones de crecimiento, la tasa de aumento fue significativamente mayor, siendo bastante comparable a la de los microcanales. Por tanto, las condiciones de grabación no pudieron explicar la mayor actividad eléctrica. La actividad eléctrica se mejoró independientemente de la eficiencia de detección del MEA, revelando el impacto de la estructura NN en la actividad celular y la discrepancia en la dinámica de picos del soma y la neurita.

La evolución a mediano plazo de la actividad eléctrica se mantuvo igual para ambas condiciones, y todas las características electrofisiológicas aumentaron globalmente con el tiempo hasta el día 15 (Fig. 3c). Curiosamente, el número máximo de electrodos activos se alcanzó antes para el NN de microfluidos confinado (es decir, 4 días antes que para el NN abierto, Fig. S2). Además, el número de electrodos activos fue significativamente mayor, de acuerdo con los gráficos ráster (Fig. 3b). Por tanto, había más electrodos activos y su activación se produjo antes en el desarrollo celular. El confinamiento y las limitaciones geométricas del entorno de microfluidos refuerzan el establecimiento de la actividad eléctrica, lo que concuerda con la maduración acelerada de las células neuronales observada previamente mediante inmunohistoquímica dentro de un chip de microfluidos similar24.

La evolución de la tasa de ráfaga siguió una tendencia similar, aumentando hasta el día 14. Los valores oscilaron entre 24 y 34 Hz ​​para las redes de microfluidos, superando con creces la tasa de ráfaga de NN aleatorios (10 veces mayor). Sin embargo, la duración de la ráfaga fue similar para las redes de control y de microfluidos, aumentando ligeramente con el tiempo de cultivo (de 50 a 250 ms) y como se esperaba para las neuronas del hipocampo4, lo que confirma la confiabilidad de los NN de microfluidos.

Los compartimentos de neuritas exhibieron patrones de actividad densos en comparación con la cámara somática, y las tasas de aumento más altas se ubicaron dentro de los compartimentos proximales que eran los más cercanos a la cámara somática (Fig. 4). Dentro de estos microcanales cortos, los patrones de puntas se caracterizaron por la mayor amplitud de puntas y variabilidad de forma. Esta variabilidad permaneció dentro de la cámara sináptica, pero las amplitudes de los picos se redujeron. En esos compartimentos cortos y sinápticos se pueden esperar tanto dendritas como axones. Sin embargo, en los microcanales distales y largos, la amplitud y la forma de las puntas fueron casi perfectamente constantes, lo que es lo esperado para los potenciales de acción transportados por los axones. Estas discrepancias se observaron en las mismas condiciones de crecimiento, todas dentro de los microcanales, y se derivan de las propiedades fisiológicas de las neuritas.

Formas de picos adquiridas en cada compartimento de microfluidos. Los datos provienen de la misma grabación en DIV 11, con el trazo de tiempo de 50 s a la izquierda y los recortes superpuestos extraídos mediante un algoritmo de clasificación de picos (detallado en métodos). De arriba a abajo, la figura muestra la traza de tiempo de voltaje típica y las formas de picos dentro del microcanal axonal largo y distante; la cámara media sináptica (sin somas); los microcanales cortos de neuritas (dendritas y axones); y la cámara somática.

Curiosamente, la actividad en la cámara somática se parecía a la de las muestras de control en términos de forma de pico y velocidad de pico (Fig. 3a). Cuando se aisló la actividad dentro de la cámara somática, la tasa de picos siguió de cerca la tendencia observada en las muestras de control, oscilando entre 0,9 y 2,5 Hz de 6 a 11 días (Fig. S2), que es un valor típico para las neuronas del hipocampo. Por lo tanto, las áreas que contienen el soma (dentro de los NN aleatorios y organizados, respectivamente) exhibieron patrones de picos comparables independientemente de la condición de crecimiento (abierto o confinado). Trabajos anteriores informaron diferencias similares entre picos somáticos y axonales (sin el entorno de microfluidos)42, lo que concuerda con nuestras observaciones y resalta aún más la relevancia fisiológica de las observaciones. Aquí, los microcanales proporcionaron una forma única de identificar y estudiar la actividad de las neuritas en áreas proximales y distantes, presumiblemente correspondientes a dendritas y axones, respectivamente.

El análisis de correlación cruzada (CC) (Fig. 5) proporcionó una cartografía funcional de las redes aleatorias y organizadas en varias etapas de su desarrollo (detallado en materiales y métodos, y consulte la Fig. S3 para la cámara somática dual). Para la muestra de control, las correlaciones se volvieron significativas en DIV11 entre grupos de electrodos dispersos aleatoriamente en toda la muestra (Fig. 5a). Su amplitud era débil pero se mantuvo constante en la red. Por el contrario, las correlaciones cruzadas se definieron espacialmente y fueron más intensas en términos de amplitud y número dentro de las redes organizadas (Fig. 5b), y también surgieron antes en DIV5.

Correlaciones dentro de NN aleatorias y organizadas. La matriz de correlación cruzada (CCM) se extrajo de los 60 canales de grabación de los MEA durante el tiempo de cultivo (un electrodo por línea y por columna; tamaño del contenedor <5 ms). De arriba a abajo: CCM obtenido en DIV11 y DIV14 para la muestra de control (izquierda) y en DIV6 y DIV11 para la muestra de microfluidos (derecha). (Abajo a la derecha) Los esquemas ilustran la posición de los canales de grabación dentro de los compartimentos de microfluidos. Luego, la barra de color inferior se usa en los ejes (x-y) de los mapas CC para resaltar la posición de cada microelectrodo: (relleno, verde azulado) en la cámara grande que contiene todo el soma, (relleno, rojo) en los microcanales y la cámara sináptica y (abierta, verde azulado) en la cámara grande vacía solo para salidas de axones (sin soma).

Los valores máximos se encontraron dentro de los microcanales largos y distales, con coeficientes de correlación medios cercanos a 1 y 0,5, respectivamente. De hecho, se pueden esperar fuertes correlaciones al medir la propagación de picos dentro del compartimento axonal, que se destaca más dentro de los microcanales distales y largos.

Las señales somáticas se correlacionaron con algunos electrodos ubicados en los microcanales y la cámara sináptica, revelando también una sincronía de largo alcance (Fig. 5b). Sus amplitudes aumentaron con el tiempo (Fig. 5d), revelando un refuerzo de la sincronía y conectividad de la red, especialmente entre los microcanales y las cámaras sinápticas y somáticas. Fueron concomitantes con una modulación de las correlaciones de corto alcance, que aumentaron entre electrodos vecinos. Este efecto podría tener varios orígenes, como la selección temporal del nodo maestro y el refuerzo de las conexiones seleccionadas. Además, podría deberse a una actividad inhibidora, ya que en nuestra cultura se esperan neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas en proporciones similares, y su maduración podría explicar la aparición de electrodos silenciosos en la etapa final de la maduración eléctrica.

Por lo tanto, los grupos de electrodos espacialmente confinados revelaron una sincronización de la subpoblación consistente con las restricciones geométricas. Las cámaras somáticas y sinápticas y los microcanales de neuritas exhibieron patrones de picos específicos (Fig. 3 y 4) y paisajes de correlación (Fig. 5) que permitieron la identificación de cada compartimento de la red. De esa manera, los circuitos de microfluidos son capaces de inducir diferencias significativas en la dinámica espaciotemporal de las redes neuronales in vitro.

Luego se evaluaron las correlaciones cruzadas a corto plazo entre cada microelectrodo para rastrear la propagación de la señal entre cada compartimento (Fig. 6). La Figura 6a evalúa primero la conectividad de la cámara somática. La característica principal fue que había mayores niveles de correlación y sincronía entre soma y neurita que entre somas. La mayoría de las correlaciones se produjeron con los microcanales proximales. Esto explica la sincronía y correlación entre las neuritas proximales (Fig. 6b, columna morada). El análisis también revela correlaciones de largo alcance tanto con la cámara sináptica como con los microcanales axonales (columnas naranja y amarilla). Así, las señales somáticas activaron eficientemente la emisión de picos dentro de microcanales axonales distantes (hasta unos pocos mm).

Correlación inmediata de trenes de púas dentro de la NN organizada. Mapeo de correlaciones a corto plazo (el retraso de la señal es de ± 2,5 ms como máximo) extraídas de las grabaciones MEA de NN de microfluidos de 11 días. Las flechas representan una correlación significativa entre los trenes de puntas de dos electrodos agrupados en 5 ms. El retraso máximo entre electrodos correlacionados es ± 2,5 ms. Los cuatro paneles (a – d) distinguen las interacciones entre (a) somas y neuritas (flecha azul) y (b – d) a lo largo de las neuritas. (b) Correlación entre los electrodos de la misma columna MEA pero dentro de diferentes microcanales (flechas moradas), que muestra la propagación hacia adelante y hacia atrás entre canales de neuritas adyacentes o sincronía entre neuritas proximales resultantes de la misma excitación. (c) Correlación entre electrodos de la misma línea MEA, por lo tanto dentro de los mismos microcanales o alineados (flechas verdes), que muestra una propagación de picos rectos; (d) Correlación entre cada electrodo ubicado dentro de los microcanales y la cámara sináptica (flechas rojas), que muestra interacciones neurita-neurita entrelazadas. Se excluyen las correlaciones directas (flechas verdes, en el Panel (c).

Entre diferentes microcanales (Fig. 6b, flecha violeta), las correlaciones aparecieron más fuertes en la cámara sináptica (n = 3,9 por electrodo, columna naranja), donde no había una barrera física para restringir la comunicación entre las neuritas. Entonces, la correlación dentro de diferentes microcanales (columnas moradas, amarillas y rojas) podría revelar la propagación hacia adelante y hacia atrás entre canales de neuritas adyacentes o la sincronía resultante de la misma excitación. Esto podría deberse, respectivamente, a bucles cerrados de neuritas (Fig. 1c) o a la proximidad entre los microcanales y las cámaras somáticas o sinápticas. El número de estas correlaciones fue mayor para los microcanales proximales, tanto en términos de número como de duración de la correlación, hasta electrodos separados por 5 pasos (n + 5). Si consideramos la arquitectura neuronal tal como la diseñamos, esto sugeriría un mayor nivel de conectividad para las dendritas y los axones proximales (ambos presentes dentro de los microcanales cortos) que para el axón distante (microcanal largo). Otros estudios deberían evaluar este punto con inmunotinción para identificar dendritas, axones y neuronas excitadoras e inhibidoras, por ejemplo. De hecho, no debemos descuidar otras posibilidades, como el impacto de las señales dendríticas (por ejemplo, EPSP e IPSP de neuronas inhibidoras y excitadoras), que pueden ocultar la actividad dentro de microcanales distantes.

La Figura 6c muestra la propagación recta a lo largo de microcanales alineados (flecha verde) y presumiblemente a lo largo de las mismas neuritas o conectadas. Nuevamente, se propagaron más señales hacia el lado izquierdo que hacia el derecho de la cámara sináptica, lo que concuerda con la posición esperada de las dendritas y los axones y el efecto de filtrado de la cámara sináptica. Estas propagaciones estuvieron dominadas por correlaciones de corta distancia, esencialmente entre electrodos vecinos (n + 1 o n + 2). Sin embargo, las interacciones de largo alcance se distinguieron claramente entre electrodos desalineados (Fig. 6d, flecha roja), y cada sitio activo se correlacionó en promedio con tres electrodos distantes (> n + 1) y un electrodo vecino (n + 1). El rango espacial de la correlación alcanzó varios milímetros (hasta n + 6). En general, esos paneles muestran que la propagación directa involucraba canales axonales, mientras que la propagación entre dendritas y dentro de la cámara sináptica estaba más distribuida espacialmente, lo que de hecho es lo esperado para las neuronas del hipocampo. La arquitectura de diseño del NN de microfluidos es funcionalmente relevante.

Luego se evaluó la direccionalidad de las comunicaciones neuronales imaginando las correlaciones cruzadas retardadas (entre 5 y 25 ms). Por lo tanto, se esperaba que los trenes de púas correlacionados compartieran un origen similar. Suponemos que un retraso positivo entre los electrodos correlacionados (A y B) indica la dirección de propagación (de A a B), independientemente de la ruta de propagación (posiblemente indirecta con nodos ocultos). Bajo este supuesto, la mayoría de las correlaciones de corto alcance observadas anteriormente fueron suprimidas, mientras que las correlaciones de largo alcance son numerosas a pesar de la distancia entre los electrodos y el ruido de fondo (Fig. 7).

Correlación a largo plazo de trenes de picos dentro de NN organizada. Mapeo de correlaciones retardadas (el retardo de la señal es de ± 25 ms como máximo) extraídas de las grabaciones MEA de NN de microfluidos de 11 días. Las flechas representan una correlación significativa con un retraso entre − 25 ms y 25 ms entre trenes de puntas de dos electrodos agrupados en 5 ms. Se excluyen las correlaciones a corto plazo con un retraso inferior a 5 ms. Los cuatro paneles (a – d) distinguen las interacciones entre (a) somas y neuritas (flecha azul) y (b – d) a lo largo de las neuritas. Se utiliza la misma representación que en la Fig. 6 para las flechas violeta, verde y roja.

La temporalidad de los eventos fue clara dentro de los microcanales alineados (Fig. 7c). Las señales se propagaron desde los microcanales cortos a los largos hacia los axones y parecían originarse en la cámara somática (Fig. 7a). Además, el mismo electrodo somático pareció activar varios canales de neuritas, lo que podría explicar la correlación observada entre esos microcanales (Fig. 7b). Dentro de los microcanales adyacentes y paralelos (Fig. 7b), las mismas neuritas podrían transportar señales (en una configuración de circuito cerrado), pero el retraso (± 5 a 25 ms) sugiere comunicaciones indirectas, presumiblemente por dendritas. Como se ilustra en la Fig. 7d, las comunicaciones eran muy complejas entre los canales cortos y largos, lo que confirma la mezcla eficiente de neuritas dentro de la cámara sináptica. La direccionalidad también se mitigó, ya que el 50% de las propagaciones se produjeron en ambas direcciones para las columnas violeta y roja (microcanales cortos y largos). Esta doble direccionalidad concuerda con la aparición de nodos de entrada y salida en la misma cámara somática (columnas verde y azul, Fig. 7a). Por esa razón, apenas podemos distinguir los eventos de retropropagación, si los hay, y su impacto en el procesamiento de señales dentro de dichos circuitos de microfluidos.

Curiosamente, observamos solo un nodo eferente y pocos (3–4) aferentes (nodos de salida y entrada, respectivamente) para ambas condiciones dentro de NN organizadas y aleatorias (Fig. 7a y Fig. S4, respectivamente). Sin embargo, el número de trenes de púas correlacionados se redujo significativamente en cultivos de control de la misma edad, lo que confirma una intensa actividad subyacente a la maduración acelerada dentro de los entornos de microfluidos. Se ha demostrado que los microcanales mejoran la eficiencia de detección y la amplitud de las señales registradas. Sin embargo, también se observaron altos niveles de actividad y sincronía en la cámara sináptica más amplia, lo que excluye un efecto aislado de la eficiencia de detección mejorada dentro de los microcanales. De este modo se demuestran las diferencias en las propiedades de codificación entre NN aleatorias y organizadas, aprovechando un alto nivel de conectividad. Si bien los somas y las neuritas podrían aislarse, este análisis subraya la complejidad de las comunicaciones neuronales y la rica posibilidad de codificación incluso dentro de una arquitectura básica de un solo nodo.

Aquí, los modelos de microfluidos NN se han explotado en un intento de definir circuitos neuronales que subyacen a los comportamientos neuronales simples. A menudo resulta difícil estudiar en detalle la propagación o las conexiones individuales y descartar la participación de neuronas no identificadas. Estas limitaciones se han superado mediante la reconstrucción de circuitos parciales que localizan las neuritas y mediante la identificación de neuronas activas y correlacionadas. Este enfoque ha brindado oportunidades para examinar el surgimiento de actividad espontánea tanto a nivel unicelular como de red, así como las comunicaciones neuronales de circuitos neuronales complejos de una manera que es inaccesible en cultivos celulares autoorganizados, al brindar acceso a la propagación de picos. dentro de los compartimentos celulares; En términos más generales, este enfoque permite evaluar las comunicaciones neuronales en general. Más allá de la estructuración de las NN, una cuestión importante era saber determinar que los circuitos de microfluidos son capaces de impulsar las propiedades funcionales de las NN. Este estudio muestra que más allá de dar forma a la organización de la red neuronal, la imposición de estructura aumenta la actividad eléctrica y las interacciones axodendríticas tanto a nivel unicelular como a nivel de red. La tasa de picos, la explosión y las correlaciones se reforzaron con el tiempo en términos de número, intensidad y modularidad, superando con creces las características electrofisiológicas de los cultivos estándar, independientemente de la eficiencia de detección de MEA. Este trabajo destaca aún más el impacto de los microfluidos en el desarrollo celular y su capacidad para dar forma tanto a la arquitectura como a la actividad del compartimento neural, sirviendo como un trampolín para el establecimiento de NN topológicos en el laboratorio.

Todo el análisis de datos se realizó con código Python personalizado utilizando paquetes disponibles públicamente como McsPy, Elephant, Neo y Viziphant. En primer lugar, se hizo referencia nuevamente a los datos de series de tiempo sin procesar de todos los electrodos de muestras organizadas para eliminar artefactos debido a una ruta resistiva importante hacia la referencia en la cámara. Los electrodos de las columnas 1 a 4 se compararon con el electrodo de referencia más cercano a la cámara que contiene las columnas 1 y 2. Por otro lado, los electrodos con los números de columna 5 a 8 se compararon con el electrodo de referencia más cercano a la cámara que contiene la columna 7 y 8 electrodos. Después de este paso, los datos se filtraron con un filtro de paso de banda Bessel de cuarto orden, con frecuencias de corte de 200 Hz y 3500 Hz. Luego, los datos de la serie temporal se convirtieron en datos del tren de picos utilizando una función de umbral de ± 5 MAD, calculada durante los 50 s de la grabación. El signo del umbral se determinó evaluando el primer cruce entre los valores positivos y negativos, es decir, la primera fase de la forma de onda de pico. Luego se utilizó para crear los trenes de picos reuniendo las marcas de tiempo de los cruces con un tiempo muerto posterior al pico de 3 ms. Luego, los electrodos con una frecuencia de disparo media de 0,1 Hz en toda la grabación se etiquetaron como "activos" y se utilizaron en análisis posteriores. Los eventos de explosión en cada electrodo se definieron mediante una sucesión de picos con un intervalo máximo entre picos de 100 ms entre ellos.

La correlación cruzada se calculó para cada par de electrodos en trenes de púas agrupados en intervalos de 5 ms; Se extrajeron los valores tanto del contenedor central como del contenedor de altura máxima (con su retraso asociado) para confirmar que se cruzó un umbral significativo en la inspección visual. Luego, utilizando esos valores, se construyeron representaciones gráficas de las comunicaciones neuronales. Las matrices de correlación se calcularon directamente a partir de los trenes de púas agrupados utilizando el paquete Elephant.

Los chips PDMS se fabricaron moldeando la imagen negativa de estructuras fotorresistentes en obleas. Brevemente, las cámaras y los microcanales se litografiaron en dos pasos utilizando diferentes espesores de MR-DWL (40 µm y 5 µm, respectivamente; Microresist Technology GmbH) y alineación posterior. Antes de verter Sylgard 184 PDMS (Dow Corning), el molde resultante se horneó en una placa caliente a 180 °C durante 30 minutos. Utilizamos una duración de curado de 2 h a 80 ° C para asegurar que la polimerización fuera completa y que los residuos no pudieran afectar el cultivo. Se perforaron aberturas para el acceso fluídico y luego se esterilizaron los chips colocándolos en EtOH/H2O al 70% y sonicándolos. Se colocaron chips MEA comerciales (60MEA200/de Multichannel Systems) dentro de una cámara de plasma para limpiarlos y hacerlos hidrófilos (100% O2, 120 mTorr, 120 s, March PX500), después de lo cual se esterilizaron inmediatamente con EtOH al 70%. Luego, las muestras organizadas se ensamblaron bajo un microscopio invertido utilizando etanol para deslizar los canales del chip PDMS sobre los electrodos. Todas las muestras se dejaron secar en una cabina de bioseguridad, se expusieron a luz ultravioleta y se enjuagaron tres veces con agua desionizada estéril.

Se utilizaron embriones de ratón E16 para proporcionar neuronas primarias del hipocampo según protocolos publicados previamente (NMRI mouse Janvier Lab)51. Brevemente, se preparó una suspensión de 10 millones de células/ml en MEM que contenía 10% de suero de caballo, 0,5% de penicilina/estreptomicina y 1% de glutamina (Thermo Fisher Scientific Inc.). Para las muestras organizadas, en cada pocillo, se inyectaron 10 µL de la solución lejos de la entrada de la cámara, comenzando por un lado, esperando 1 minuto a que las células se asentaran y luego llenando el otro lado. Para las muestras aleatorias, la suspensión se diluyó en un factor de 50 y se sembraron nuevos cultivos con 1 ml de solución. Todas las muestras se dejaron durante 10 minutos para permitir que las células se adhirieran. Las muestras se colocaron dentro de una incubadora con una atmósfera de 5% de CO2. Dos horas más tarde, los pocillos de los chips PDMS se llenaron con 100 µl de medio nuevo (Neurobasal acondicionado con glía). Los medios se cambiaron cada 48 h, compensando la evaporación. En el estudio no se utilizaron animales vivos ni humanos.

Las células se fijaron en paraformaldehído al 3,7% (diluido en PBS) durante 10 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 5 minutos y se bloquearon en PBS-albúmina sérica bovina al 2%. Después de ser fijadas, las células se incubaron con DAPI (Invitrogen) para marcar los núcleos y se eligieron pares de anticuerpos primarios y secundarios para localizar las neuritas (anti-YL1/2) y las sinapsis (anti-sinapsina); Estos anticuerpos se diluyeron en PBS que contenía albúmina sérica bovina al 10% antes de aplicarse. Las micrografías de fluorescencia se recogieron utilizando un microscopio Olympus BX51 o Zeiss AxioImager M2.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a Bruno Fernández por el mantenimiento y la asistencia en las instalaciones de la sala limpia, y a Gael Moireau y Pierre Gasner por su asistencia en la gestión del laboratorio de cultivo celular. El proyecto recibió una subvención de la agencia de investigación de Francia (ANR-18-CE42-0003 NANOMESH).

Institut Néel, Universidad Grenoble Alpes, CNRS, Grenoble INP, 38000, Grenoble, Francia

Victor Dupuit y Cécile Delacour

Laboratorio HP2, Universidad Grenoble Alpes, Instituto Nacional de Salud e Investigación Médica U1300, Grenoble, Francia

Anne Briançon-Marjollet

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VD realizó las muestras, las adquisiciones eléctricas y los análisis de datos bajo la supervisión de CD; AB-M. y CD realizó los cultivos celulares y los ensayos inmunofluorescentes; CD concibió y supervisó el proyecto y escribió el manuscrito. VD preparó las Figs. 5, 6 y 7. Todos los autores discutieron los resultados y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Cécile Delacour.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Dupuit, V., Briançon-Marjollet, A. y Delacour, C. Retrato de comunicaciones intensas dentro de redes neuronales de microfluidos. Representante científico 13, 12306 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39477-9

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Recibido: 25 de abril de 2023

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39477-9

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